垂体功能减退症必须在确诊之后，才能对病人施行终身激素替代治疗。要寻找根据以证明垂体结构异常和激素缺乏。蝶鞍的X线检查以及正规的视野测定，能够发现肿瘤。高分辨CT扫描(必要时使用造影剂)是诊断垂体腺瘤首选的诊断技术。如果没有条件进行高分辨CT扫描，蝶鞍的多层X线断层摄影就成为一项主要的诊断手段。只有当动态CT扫描表明蝶鞍周围血管有可能存在异常或动脉瘤时，才需进行脑血管造影。如果病人所在的地区没有现代化的神经放射学诊断设备的话，可对蝶鞍进行一次锥形侧面X线摄影，这对于直径大于10mm的垂体巨腺瘤仍不失为一项合理的鉴别诊断法。
一旦怀疑为全垂体功能减退症，首先要检查有无TSH和ACTH的不足，因为这两种激素的缺乏都对生命具有潜在的威胁。
为了诊断病人有无甲状腺功能减退，可用放射免疫法测定T4、T3和TSH的水平。所测定的结果均应属于低下，因为TSH水平升高意味着甲状腺的异常是原发性的。在15～20秒钟内静脉内注射200～500μg的促甲状腺激素释放激素(Protirelin，一种人工合成的TRH)有助于鉴别诊断病人是属于下丘脑或垂体本身功能障碍。一般情况下在注射后30分钟可观察到TSH对TRH的反应达到高峰水平。在下丘脑疾病的患者中可能见到血浆中TSH水平升高延迟。遗憾的是，某些原发性垂体疾病的患者也具有这样一种异常的TSH反应。
ACTH分泌的评价始于收集24小时尿标本以测定其尿中游离的皮质醇和17—OHCS。在垂体功能减退症这两种物质的水平应该是降低的。遗憾的是，基础的皮质醇分泌往往正常，即使在早期或部分垂体功能减退时释放ACTH的能力降低的情况下，也是如此。由此可见，评价ACTH分泌的贮备能力更具有实际意义。如果肾上腺皮质功能正常，在15～30秒钟内静脉注入0．25mg二十四肽促皮质素(cosyntropin)后，或2小时血浆皮质醇应该出现明显的升高(至少升高7μg/dL，或者达到20μg/dL以上的水平)。在原发性肾上腺功能不全(Addison氏病)时，对该刺激的反应便会减弱。但是，ACTH缺乏如果持续时间很长，那么皮质醇的反应也可能减弱。所以对于评价ACTH(对评价GH和PRL亦然)贮备能力说来最可靠的方法是胰岛素耐受试验。在15～30秒钟静脉注入0．1u．/kg体重剂量的正规胰岛素，然后在0分钟(即注射胰岛素前)和20、30、45、60、90分钟时分别取静脉血样，测定GH，皮质醇和葡萄糖。如果血清葡萄糖水平并不出现50%以上的下降，达到40mg/dL以下的水平的话，那么该试验应予重做。对于确诊为重症全垂体功能减退症，糖尿病患者和老年人说来，这一试验具有危险性：如有缺血性心脏病或癫痫存在，则此试验属禁忌。所以，在进行该试验时，必须备有医疗监护。通常在做此试验时只有一过性的出汗，心动过速和神经紧张。一旦病人诉说心悸，失去知觉，或者出现癫痫发作，应该立即停止该试验，井从静脉注入50%葡萄糖溶液。
单做胰岛素耐受试验并不能鉴别原发性(Addison氏病)和继发性(垂体性)肾上腺功能不全，除非同时进行ACTH和皮质醇的测定。遗憾的是耍精确测定血浆ACTH浓度，现在还很难做到。
在做甲双吡丙酮(metyrapone)试验时，由于皮质醇前体的11—羟化作用被甲双吡丙酮所阻断，血浆皮质醇水平会下降。在正常人体内，皮质醇水平下降会刺激ACTH增多，并导致皮质醇的前体(特别是其中的11—去氧皮质醇)的生产增加，并以17—OHCS的形式从尿中排出。因为甲双吡丙酮试验仅可测试类固醇抑制性的ACTH的分泌，所以那些并能抑制的应激反应(例如外科手术)便可能引起ACTH的释放，即使对那些不会对甲双吡丙酮发生反应的病人亦然。连续2天取24小时的尿样，并测定17—OHCS的基线水平。到了第3日，从早晨8时起给予口服750mg(对儿童则为300mg/m^2体表面积)甲双吡丙酮，以后每4小时1次，共用6次，成人总量为4．5g。如果在这样处理的最后1天(即第4日)，或者在这样处理后隔1天，尿中17—OHCS没有增加1倍，或者血浆中11—去氧皮质醇没有超过10μg/dL的水平，则为异常。常有头晕和恶心发生，但卧床休息便可减轻。因为对甲双吡丙酮反应的缺如可以表明下丘脑—垂体功能不全或肾上腺衰竭，所以在第4天做一次ACTH刺激试验往往是有益的。
肾上腺功能减退症或垂体功能减退症患者对甲双吡丙酮的反应往往降低或缺如。但是有些下丘脑或垂体疾病的患者有正常的反应。甲双吡丙酮代谢增高的正常人，甲状腺功能亢进的病人，某些孕妇以及服用苯妥英或雌激素的病人，该反应亦可不正常。
促皮质激素释放激素(CRH)试验：近来发现和合成的CRH，为下丘脑—垂体—肾上腺功能的测定提供了一个较前述任何一个试验都好的手段；但是现在其使用仍属于科研范围之内。在20秒钟内静脉注入1μg/kg的CRH似可引起ACTH和皮质醇这两者的最大反应。血浆ACTH在CRH注射后2分钟内即可升高，而在10～15分钟内则出现第1个高蜂。在第1个高峰以后，ACTH的浓度便下降，但在第3小时又形成第2高峰：血浆皮质醇的升高则较促，要在注射后10分钟以后才开始，并在30～60分钟之间达到峰值。
患有原发性肾上腺功能不全的患者对CRH的反应明显增强，大概是因为CRH作用于垂体时没有糖皮质激素的立即负反馈抑制之故。患有继发性肾上腺功能不全的病人对ACTH或者没有反应，或者反应很弱(大概是由于原发性垂体性ACTH不足)，或者反达增强并延长(可能是由于原发性下丘脑性CRH不足)。虽然现在有较为简单和较为直接的方法可以诊断原发性肾上腺皮质功能不全，但进一步的研究可能表明，CRH在鉴别继发性肾上腺功能不全的原因为下丘脑或垂体方面是有价值的。
在患全垂体功能减退症患者体内，PRL水平并不总是降低的。事实上，如果催乳激素细胞已经摆脱了多巴胺的抑制效应，高水平的PRL也可见于下丘脑性疾病。
GH的测定只有在几个激发性刺激中挑选一种进行刺激，以后再行测定才有价值：因为在甲状腺或肾上腺功能减低的个体内，GH反应往往是异常的，所以只有在适当的激素替代疗法之后才能做该项试验。胰岛素耐受试验是释放GH的最有效刺激。下列GH释放试验危险性较小，但是可靠性也较小：使用精氨酸灌注(30分钟内静脉注射500mg/kg)，口服左旋多巴(成人用量500mg，儿童用量10mg/kg)，睡眠，或者20分钟的激烈运动。氯压定(clonidine，4μg/kg口服)是又一种对GH分泌的强有力的兴奋剂，而且很有可能用作胰岛素的替代品。其副反应仅为嗜唾和血压的稍稍下降。一般说来，只要GH值>10ng/ml，或者在1次刺激之后的反应值>5ng/ml，都足以排除GH不足的存在。GH的升高值<5ng/ml，或者其水平<10mg/ml，这类现象都难以解释。每一次正常反应的产生都具有随意性，而GH分泌的所有的激发性试验偶尔又会产生错误的结果。因为没有任何一种试验对于引起GH的释放是100%的有效，所以在不出现GH反应时，至少应该进行2种不同的测试。一般说来，GH水平达到蜂值的时间如下：胰岛素使用后30～90分钟，精氨酸灌注开始后30～90分钟，左旋多巴使用后30～120分钟，睡着后和氯压定使用后60～120分钟，激烈活动20分钟后。
外源性GRH对于了解GH的分泌是否有用，迄今尚未肯定。在15～30秒钟内静脉注射1μg/kgGRH可以引起GH的极度释放，但是其释放量又变化较大，典型的情况是于GRH注射后60分钟达到峰值。假若GH对GRH反应缺如或只轻度增强，就可以确定某些人具有GH不足：但是其反应方式能否鉴别原发性下丘脑疾病和垂体疾病则尚未阐明。
测定基础状态下的血清LH和FSH的水平对于判断绝经后没有使用外源性雌激素的妇女的垂体功能减退症是极有价值的。在正常情况下，她们循环血中的促性腺激素的浓度偏高(>40mlU/ml)。但对于其他病人说来，测定LH和FSH的基础水平价值不大。尽管在全垂体功能减退症时促性腺激素水平偏低，但是与正常范围的LH和FSH却存在着交叉重叠。如果静脉注射100μg的盐酸促性腺激素释放因子(即合成的GnRH))LH和FSH的水平应会升高，LH的峰值出现在注射后约30分钟时，FSH的峰值则出现在注射后40分钟时。但是在下丘脑垂体功能失调时也可见到对GnRH的反应正常、减弱或缺如。LH和FSH对GnRH反应的正常性增加是变化多端的。此外，外源性GnRH的使用无助于鉴别原发性下丘脑疾病与原发性垂体疾病。
对于评价垂体功能最有效的方法莫过于同时测定几种激素的垂体贮备。可以在15～30秒钟内一起静脉注射胰岛索0．1u．/kg正规胰岛素)、TRH(200μg)和GnRH(100μg)。在嗣后的180分钟里间隔一定时间测定一次葡萄糖、皮质醇、GH、TSH、催乳索、LH、FSH和ACTH的水平。另外一种方法是，首先单用胰岛素注射，120分钟后再同时注射TRH和GnRH。有人主张：在静脉注射GRH(1μg/kg)和CRH(1μg/kg)的同时注射TRH和GnRH，而不再需要把胰岛索作为垂体前叶功能复合试验的组成部分加以使用。总之，现在已经能够买得到的这些释放激素对于测试垂体功能的实用价值，仍然有待研究确定。不管怎样，其正常反应还是和过去描述的情况一样。
